金沙官网线上FastQC

# -t --threads 选择程序运行的线程数,每个线程会占用250MB内存,越多越快咯

# 图中四条线代表A T C G在每个位置平均含量

# 纵轴是每个值对应的reads数目

# Encoding指测序平台的版本和相应的编码版本号,这个在计算Phred反推error P的时候有用

wget http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.5.zip

 

重复短序列

 

# 对于这种情况,我的办法是可以cut掉前面的一些长度,可以试着cut 5~8bp

3、 给予执行权限,否则执行的时候会显示没有权限

 

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序列测序质量统计

# 本例中adapter都已经去除,如果有adapter序列没有去除干净的情况,在后续分析的时候需要先使用cutadapt软件进行去接头

# 蓝色的线是程序根据经验分布给出的理论值,红色是真实值,两个应该比较接近才比较好

# 横轴是0 - 100%; 纵轴是每条序列GC含量对应的数量

# 比如此图中,101bp是主要的,但是还是有少量的100和102bp的长度,不过数量比较少,不影响后续分析

# 假如我测的1条序列长度为101bp,那么这101个位置每个位置Q值的平均值就是这条reads的质量值

 

5、测试

每个tail测序的情况

export PATH=/home/h/FastQC/:$PATH

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# 该图横轴是0-40,表示Q值

# 横轴是1 - 101 bp;纵轴是百分比

# 如果在当时fastqc分析的时候-a选项没有内容,则默认使用图例中的四种通用adapter序列进行统计

# 这张图中的信息良好

# 此图中的横轴是测序序列第1个碱基到第101个碱基

基本信息

 

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fastqc --help

# 蓝色代表测序质量很高,暖色代表测序质量不高,如果某些tail出现暖色,可以在后续分析中把该tail测序的结果全部都去除

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# 我们的数据中,测序结果主要集中在高分中,证明测序质量良好!

fastqc -o ./tmp.result/fastQC/ -t 6 ./tmp.data/fastq/H1EScell-dnase-2014-GSE56869_20151208_SRR1248176_1.fq

1、下载fastqc

# 一般要求此图中,所有位置的10%分位数大于20,也就是我们常说的Q20过滤

 

cd FastQC
chmod 755 fastqc

# Warning 报警 如果任何碱基质量低于10,或者是任何中位数低于25

# 图中蓝色的细线是各个位置的平均值的连线

序列Adapter

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整个报告分成若干个部分。合格会有个绿色的对勾,警告是个“!”,不合格是个红色的叉子

 

 

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每条序列的测序质量统计

GC 含量统计

 

序列测序长度统计

 

unzip fastqc_v0.11.5.zip

 

# 每次测序仪测出来的长度在理论上应该是完全相等的,但是总会有一些偏差

 

# 我们可以看到1-8bp的时候图例中的几种短序列都出现了非常多的次数,一般来说,出现这种情况,要么是adapter没有去除干净,而又没有使用-a参数;要么就是序列本身可能重复度比较高,如建库PCR的时候出现了bias

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# 理论上来说,A和T应该相等,G和C应该相等,但是一般测序的时候,刚开始测序仪状态不稳定,很可能出现上图的情况。像这种情况,即使测序的得分很高,也需要cut开始部分的序列信息,一般像我碰到这种情况,会cut前面5bp

# 纵轴是质量得分,Q = -10*log10(error P)即20表示1%的错误率,30表示0.1%

# 所以上面的这个测序结果,需要把后面的87bp以后的序列切除,从而保证后续分析的正确性

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# Failure 报错 如果任何碱基质量低于5,或者是任何中位数低于20

4、加入到PATH

# -o --outdir FastQC生成的报告文件的储存路径,生成的报告的文件名是根据输入来定的

#金沙官网线上, 当测序的长度不同时,如果很严重,则表明测序仪在此次测序过程中产生的数据不可信 

# 纵轴是tail的Index编号

# 横轴和之前一样,代表101个碱基的每个不同位置

# Total Sequences记录了输入文本的reads的数量

# 图中每1个boxplot,都是该位置的所有序列的测序质量的一个统计,上面的bar是90%分位数,下面的bar是10%分位数,箱子的中间的横线是50%分位数,箱子的上边是75%分位数,下边是25%分位数

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# 此图衡量的是序列中两端adapter的情况

# 当红色的线出现双峰,基本肯定是混入了其他物种的DNA序列

 

序列平均GC含量分布图

# %GC是我们需要重点关注的一个指标,这个值表示的是整体序列中的GC含量,这个数值一般是物种特异的,比如人类细胞就是42%左右

# 这个图主要是为了防止在测序过程中,某些tail受到不可控因素的影响而出现测序质量偏低

# 这个图统计的是,在序列中某些特征的短序列重复出现的次数

FastQC的报告介绍

使用例子

# Sequence length是测序的长度

2、解压

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